近日，南昌大學食品科學與技術學院付桂明教授主導的研究成果“Deciphering the Molecular Adapting Mechanism of Lactic Acid-Tolerant Saccha-romyces cerevisiae Through Genomic and Transcriptomic Analysis”在《Foods》期刊上發(fā)表。
本研究采用常壓室溫等離子體(ARTP)誘變結合全自動高通量微生物液滴培養(yǎng)系統(tǒng)(Microbial Microdroplet Culture system，MMC)篩選出耐4%(v/v)乳酸的突變株NCUF309.5-44。此研究首次將多組學技術應用于白酒釀造酵母的耐乳酸機制研究，并發(fā)現(xiàn)該菌株通過激活GSH/GPx抗氧化系統(tǒng)、強化細胞膜質(zhì)子泵功能及增強糖酵解代謝等協(xié)同機制提升耐受力。研究結果不僅為解析酵母耐乳酸機制提供新視角，還為工業(yè)菌株改良及固態(tài)白酒發(fā)酵工藝優(yōu)化提供理論依據(jù)。
一、研究背景
1. 傳統(tǒng)固態(tài)白酒釀造工藝的特點與挑戰(zhàn)
傳統(tǒng)中國白酒的固態(tài)釀造過程，發(fā)酵和蒸餾在無大量游離液體的條件下進行，酒醅作為發(fā)酵混合物，其環(huán)境因素在釀造過程中不斷動態(tài)變化。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作為酒醅發(fā)酵過程中的優(yōu)勢微生物，易受到多種環(huán)境脅迫因素影響，如有機酸、乙醇、溫度波動和滲透壓等。這些脅迫會導致發(fā)酵速率降低、還原糖降解減少，最終影響發(fā)酵效率和白酒品質(zhì)。
2. 乳酸在固態(tài)白酒釀造中的關鍵作用與影響
在傳統(tǒng)固態(tài)白酒釀造過程中，乳酸是最主要的有機酸，其積累(濃度可達3.62%±0.62%)會顯著抑制釀酒酵母的生長和代謝，導致發(fā)酵效率下降及最終產(chǎn)品品質(zhì)降低。針對高濃度乳酸脅迫下基因突變菌株的研究仍較為缺乏。
3. 酵母耐酸機制研究現(xiàn)狀
目前，關于酵母對酸脅迫潛在機制的研究文獻，主要集中在生物質(zhì)轉化和有機酸工業(yè)生產(chǎn)領域。例如，有研究表明酵母在木質(zhì)纖維素轉化過程中，可通過減緩某些氨基酸和核苷酸的合成、降低能量消耗，來增強對甲酸的耐受性并實現(xiàn)自我保護 ;還有研究發(fā)現(xiàn)酵母能夠改變細胞壁結構以增加硬度，從而提高對乙酸脅迫的耐受性。但針對釀酒酵母在白酒釀造環(huán)境下對乳酸的耐受機制研究仍較為缺乏。
二、菌株培養(yǎng)與特性分析
1. 菌株培養(yǎng)：
①菌株選擇與培養(yǎng)：
本研究選用了前期通過特定技術手段獲得的耐乳酸釀酒酵母菌株NCUF309.5-44，以及野生型菌株作為研究對象。其中，耐乳酸菌株的獲得，大氣壓室溫等離子體(ARTP)誘變與微生物微滴培養(yǎng)(MMC)技術發(fā)揮了關鍵作用。
②培養(yǎng)條件設置：
將兩種菌株分別接種于含有不同濃度乳酸的YPD培養(yǎng)基中，重點研究在4%(v/v)乳酸濃度下的生長情況，該濃度模擬固態(tài)白酒釀造中后期酒醅中較高的乳酸含量。在設定的時間間隔(如0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、16h等)取樣，測定細胞生長密度(如OD600值)，繪制生長曲線，以了解菌株在乳酸脅迫下的生長動態(tài)。
③代謝性能測定：
通過對比耐乳酸菌株和野生型菌株在相同培養(yǎng)時間下的還原糖利用率和乙醇產(chǎn)量，評估乳酸脅迫對代謝性能的影響以及耐乳酸菌株在代謝方面的優(yōu)勢。
④抗氧化酶活性檢測：
在不同培養(yǎng)時間點收集細胞，破碎后提取蛋白，采用相應的生化檢測方法，測定超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)等抗氧化酶的活性。分析抗氧化酶活性在乳酸脅迫下的變化趨勢，探究菌株如何通過調(diào)節(jié)抗氧化系統(tǒng)來應對乳酸誘導的氧化應激。
⑤基因組分析：
①測序與數(shù)據(jù)獲取：對耐乳酸菌株和野生型菌株進行全基因組重測序;
②序列比對與變異檢測：將處理后的讀段與釀酒酵母的參考基因組進行比對，統(tǒng)計SNP和Indel的數(shù)量、分布位置，確定在編碼區(qū)、非編碼區(qū)以及基因間區(qū)的變異情況。
③變異基因功能注釋：對于檢測到的發(fā)生變異的基因，借助各類數(shù)據(jù)庫進行功能注釋。
分析這些基因所參與的生物學過程、分子功能以及細胞組成相關信息，初步篩選出可能與乳酸耐受相關的基因。
⑥轉錄組分析：
①RNA提取與測序：分別提取在4 %
(v/v)乳酸脅迫下耐乳酸菌株和野生型菌株不同時間點的總RNA，確保RNA的完整性和純度滿足測序要求。采用高通量RNA測序技術(RNA-seq)，構建測序文庫并進行測序，獲取基因轉錄本的序列信息和表達量數(shù)據(jù);
②數(shù)據(jù)處理與差異基因篩選：對測序得到的原始數(shù)據(jù)進行標準化處理，將讀段比對到參考基因組上，計算每個基因的表達量。通過統(tǒng)計學分析方法，比較耐乳酸菌株和野生型菌株在乳酸脅迫下的基因表達譜，篩選出差異表達基因;
③差異基因功能富集分析：對篩選出的差異表達基因進行GO(Gene Ontology)功能富集分析，將基因歸類到生物過程、分子功能和細胞組成三大類功能注釋中，找出在乳酸脅迫下顯著富集的GO條目，明確菌株在細胞代謝、應激反應等方面的變化。同時進行KEGG(Kyoto
Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析，確定差異基因顯著富集的代謝通路和信號轉導通路，進一步揭示耐乳酸菌株應對乳酸脅迫的分子機制。
2. 菌株特性分析
①基因組水平的適應性進化
研究發(fā)現(xiàn)，乳酸耐受菌株在基因組水平表現(xiàn)出顯著的適應性突變。這些突變主要集中在與質(zhì)子轉運、細胞膜完整性和應激響應相關的功能基因上。通過比較基因組分析，鑒定出多個與乳酸耐受性顯著相關的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)和插入缺失變異(Indels)，這些遺傳變異共同構成了菌株耐受性的基礎。
②轉錄調(diào)控網(wǎng)絡的系統(tǒng)性重塑
在轉錄水平上，耐受菌株表現(xiàn)出全局性的基因表達重編程。核心調(diào)控因子的表達顯著上調(diào)，激活了下游約200個靶基因的表達。這些靶基因主要涉及：①細胞膜轉運系統(tǒng);②離子穩(wěn)態(tài)維持;③細胞壁生物合成。值得注意的是，糖酵解途徑關鍵酶基因的表達普遍提高，而TCA循環(huán)相關基因則呈現(xiàn)差異化表達模式。
③氧化應激防御系統(tǒng)的強化
耐受菌株建立了多層次的抗氧化防御體系：①超氧化物歧化酶(SOD)活性提高;②過氧化氫酶(CAT)活性增加;③谷胱甘肽代謝相關酶活性顯著增強。這些變化使菌株的ROS清除能力提升3倍以上，有效緩解了乳酸脅迫誘導的氧化損傷。同時，硫氧還蛋白系統(tǒng)和DNA修復酶的表達上調(diào)，進一步增強了細胞的修復能力。
圖 1.原始菌株和乳酸耐受菌株之間
SNP 和 InDel 的 GO 注釋 （a） 和 KEGG 富集 （b）
結果。
圖 2.乳酸脅迫下原始菌株和耐乳酸菌株之間 DEGs 的 KEGG 富集分析結果 （（a）：上-DRGs;（b）：下 DEGs）
表 1 4%的乳酸對原始菌株和耐乳酸菌株抗氧化酶活性的影響。
四、研究亮點
1. 多組學整合揭示全局適應機制
首次通過基因組、轉錄組和代謝組的聯(lián)合分析，系統(tǒng)解析了釀酒酵母乳酸耐受的多層次調(diào)控網(wǎng)絡。鑒定出了58個關鍵基因突變和1235個差異表達基因。
2. 關鍵調(diào)控因子的發(fā)現(xiàn)與驗證
研究首次闡明了轉錄因子協(xié)同調(diào)控乳酸耐受的新機制，鑒定出核心調(diào)控樞紐及其下游靶基因網(wǎng)絡。基于這些發(fā)現(xiàn)成功開發(fā)出具有顯著提升耐受性能的工程菌株，并建立了高效的分子標記篩選體系，體現(xiàn)了基礎研究向應用轉化的重要價值。
3. 防御系統(tǒng)的協(xié)同作用解析
研究深入揭示了抗氧化系統(tǒng)與細胞膜重塑在乳酸耐受中的協(xié)同保護作用，通過建立定量關系模型，為理解微生物應對環(huán)境脅迫的系統(tǒng)性適應策略提供了新見解，也為工業(yè)菌株的理性設計奠定了理論基礎。
近日，南昌大學食品科學與技術學院付桂明教授主導的研究成果“Deciphering the Molecular Adapting Mechanism of Lactic Acid-Tolerant Saccha-romyces cerevisiae Through Genomic and Transcriptomic Analysis”在《Foods》期刊上發(fā)表。
本研究采用常壓室溫等離子體(ARTP)誘變結合全自動高通量微生物液滴培養(yǎng)系統(tǒng)(Microbial Microdroplet Culture system，MMC)篩選出耐4%(v/v)乳酸的突變株NCUF309.5-44。此研究首次將多組學技術應用于白酒釀造酵母的耐乳酸機制研究，并發(fā)現(xiàn)該菌株通過激活GSH/GPx抗氧化系統(tǒng)、強化細胞膜質(zhì)子泵功能及增強糖酵解代謝等協(xié)同機制提升耐受力。研究結果不僅為解析酵母耐乳酸機制提供新視角，還為工業(yè)菌株改良及固態(tài)白酒發(fā)酵工藝優(yōu)化提供理論依據(jù)。
一、研究背景
1. 傳統(tǒng)固態(tài)白酒釀造工藝的特點與挑戰(zhàn)
傳統(tǒng)中國白酒的固態(tài)釀造過程，發(fā)酵和蒸餾在無大量游離液體的條件下進行，酒醅作為發(fā)酵混合物，其環(huán)境因素在釀造過程中不斷動態(tài)變化。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作為酒醅發(fā)酵過程中的優(yōu)勢微生物，易受到多種環(huán)境脅迫因素影響，如有機酸、乙醇、溫度波動和滲透壓等。這些脅迫會導致發(fā)酵速率降低、還原糖降解減少，最終影響發(fā)酵效率和白酒品質(zhì)。
2. 乳酸在固態(tài)白酒釀造中的關鍵作用與影響
在傳統(tǒng)固態(tài)白酒釀造過程中，乳酸是最主要的有機酸，其積累(濃度可達3.62%±0.62%)會顯著抑制釀酒酵母的生長和代謝，導致發(fā)酵效率下降及最終產(chǎn)品品質(zhì)降低。針對高濃度乳酸脅迫下基因突變菌株的研究仍較為缺乏。
3. 酵母耐酸機制研究現(xiàn)狀
目前，關于酵母對酸脅迫潛在機制的研究文獻，主要集中在生物質(zhì)轉化和有機酸工業(yè)生產(chǎn)領域。例如，有研究表明酵母在木質(zhì)纖維素轉化過程中，可通過減緩某些氨基酸和核苷酸的合成、降低能量消耗，來增強對甲酸的耐受性并實現(xiàn)自我保護 ;還有研究發(fā)現(xiàn)酵母能夠改變細胞壁結構以增加硬度，從而提高對乙酸脅迫的耐受性。但針對釀酒酵母在白酒釀造環(huán)境下對乳酸的耐受機制研究仍較為缺乏。
二、菌株培養(yǎng)與特性分析
1. 菌株培養(yǎng)：
①菌株選擇與培養(yǎng)：
本研究選用了前期通過特定技術手段獲得的耐乳酸釀酒酵母菌株NCUF309.5-44，以及野生型菌株作為研究對象。其中，耐乳酸菌株的獲得，大氣壓室溫等離子體(ARTP)誘變與微生物微滴培養(yǎng)(MMC)技術發(fā)揮了關鍵作用。
②培養(yǎng)條件設置：
將兩種菌株分別接種于含有不同濃度乳酸的YPD培養(yǎng)基中，重點研究在4%(v/v)乳酸濃度下的生長情況，該濃度模擬固態(tài)白酒釀造中后期酒醅中較高的乳酸含量。在設定的時間間隔(如0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、16h等)取樣，測定細胞生長密度(如OD600值)，繪制生長曲線，以了解菌株在乳酸脅迫下的生長動態(tài)。
③代謝性能測定：
通過對比耐乳酸菌株和野生型菌株在相同培養(yǎng)時間下的還原糖利用率和乙醇產(chǎn)量，評估乳酸脅迫對代謝性能的影響以及耐乳酸菌株在代謝方面的優(yōu)勢。
④抗氧化酶活性檢測：
在不同培養(yǎng)時間點收集細胞，破碎后提取蛋白，采用相應的生化檢測方法，測定超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)等抗氧化酶的活性。分析抗氧化酶活性在乳酸脅迫下的變化趨勢，探究菌株如何通過調(diào)節(jié)抗氧化系統(tǒng)來應對乳酸誘導的氧化應激。
⑤基因組分析：
①測序與數(shù)據(jù)獲取：對耐乳酸菌株和野生型菌株進行全基因組重測序;
②序列比對與變異檢測：將處理后的讀段與釀酒酵母的參考基因組進行比對，統(tǒng)計SNP和Indel的數(shù)量、分布位置，確定在編碼區(qū)、非編碼區(qū)以及基因間區(qū)的變異情況。
③變異基因功能注釋：對于檢測到的發(fā)生變異的基因，借助各類數(shù)據(jù)庫進行功能注釋。
分析這些基因所參與的生物學過程、分子功能以及細胞組成相關信息，初步篩選出可能與乳酸耐受相關的基因。
⑥轉錄組分析：
①RNA提取與測序：分別提取在4 %
(v/v)乳酸脅迫下耐乳酸菌株和野生型菌株不同時間點的總RNA，確保RNA的完整性和純度滿足測序要求。采用高通量RNA測序技術(RNA-seq)，構建測序文庫并進行測序，獲取基因轉錄本的序列信息和表達量數(shù)據(jù);
②數(shù)據(jù)處理與差異基因篩選：對測序得到的原始數(shù)據(jù)進行標準化處理，將讀段比對到參考基因組上，計算每個基因的表達量。通過統(tǒng)計學分析方法，比較耐乳酸菌株和野生型菌株在乳酸脅迫下的基因表達譜，篩選出差異表達基因;
③差異基因功能富集分析：對篩選出的差異表達基因進行GO(Gene Ontology)功能富集分析，將基因歸類到生物過程、分子功能和細胞組成三大類功能注釋中，找出在乳酸脅迫下顯著富集的GO條目，明確菌株在細胞代謝、應激反應等方面的變化。同時進行KEGG(Kyoto
Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析，確定差異基因顯著富集的代謝通路和信號轉導通路，進一步揭示耐乳酸菌株應對乳酸脅迫的分子機制。
2. 菌株特性分析
①基因組水平的適應性進化
研究發(fā)現(xiàn)，乳酸耐受菌株在基因組水平表現(xiàn)出顯著的適應性突變。這些突變主要集中在與質(zhì)子轉運、細胞膜完整性和應激響應相關的功能基因上。通過比較基因組分析，鑒定出多個與乳酸耐受性顯著相關的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)和插入缺失變異(Indels)，這些遺傳變異共同構成了菌株耐受性的基礎。
②轉錄調(diào)控網(wǎng)絡的系統(tǒng)性重塑
在轉錄水平上，耐受菌株表現(xiàn)出全局性的基因表達重編程。核心調(diào)控因子的表達顯著上調(diào)，激活了下游約200個靶基因的表達。這些靶基因主要涉及：①細胞膜轉運系統(tǒng);②離子穩(wěn)態(tài)維持;③細胞壁生物合成。值得注意的是，糖酵解途徑關鍵酶基因的表達普遍提高，而TCA循環(huán)相關基因則呈現(xiàn)差異化表達模式。
③氧化應激防御系統(tǒng)的強化
耐受菌株建立了多層次的抗氧化防御體系：①超氧化物歧化酶(SOD)活性提高;②過氧化氫酶(CAT)活性增加;③谷胱甘肽代謝相關酶活性顯著增強。這些變化使菌株的ROS清除能力提升3倍以上，有效緩解了乳酸脅迫誘導的氧化損傷。同時，硫氧還蛋白系統(tǒng)和DNA修復酶的表達上調(diào)，進一步增強了細胞的修復能力。
圖 1.原始菌株和乳酸耐受菌株之間
SNP 和 InDel 的 GO 注釋 （a） 和 KEGG 富集 （b）
結果。
圖 2.乳酸脅迫下原始菌株和耐乳酸菌株之間 DEGs 的 KEGG 富集分析結果 （（a）：上-DRGs;（b）：下 DEGs）
表 1 4%的乳酸對原始菌株和耐乳酸菌株抗氧化酶活性的影響。
四、研究亮點
1. 多組學整合揭示全局適應機制
首次通過基因組、轉錄組和代謝組的聯(lián)合分析，系統(tǒng)解析了釀酒酵母乳酸耐受的多層次調(diào)控網(wǎng)絡。鑒定出了58個關鍵基因突變和1235個差異表達基因。
2. 關鍵調(diào)控因子的發(fā)現(xiàn)與驗證
研究首次闡明了轉錄因子協(xié)同調(diào)控乳酸耐受的新機制，鑒定出核心調(diào)控樞紐及其下游靶基因網(wǎng)絡。基于這些發(fā)現(xiàn)成功開發(fā)出具有顯著提升耐受性能的工程菌株，并建立了高效的分子標記篩選體系，體現(xiàn)了基礎研究向應用轉化的重要價值。
3. 防御系統(tǒng)的協(xié)同作用解析
研究深入揭示了抗氧化系統(tǒng)與細胞膜重塑在乳酸耐受中的協(xié)同保護作用，通過建立定量關系模型，為理解微生物應對環(huán)境脅迫的系統(tǒng)性適應策略提供了新見解，也為工業(yè)菌株的理性設計奠定了理論基礎。
